本試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中人Ⅴ型膠原(COL5)的含量。

有效期：6個月

保存條件：2-8℃

人Ⅴ型膠原(COL5)試劑盒組成：

備注：

1.（96T/48T）打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全。

2. 標準品濃度依次為：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 經過大量正常標本檢驗，標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當有部分樣本值超過標準品濃度時，可用樣本稀釋液將標本進行適當稀釋后再進行實驗。

檢測前準備工作：

1.請提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

2.從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶，屬于正常現象；放置室溫，輕搖均勻，待結晶溶解后再配置洗滌液。可將20ml濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水稀釋配置成400ml工作濃度的洗滌液，未用完的放回4℃

3.20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

實驗原理：

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被人Ⅴ型膠原(COL5)捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成的黃色。顏色的深淺和樣品中的人Ⅴ型膠原(COL5)呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

實驗所需自備試驗器材：

1.酶標儀（450nm）

2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水或去離子水

人Ⅴ型膠原(COL5)試劑盒樣本處理及要求：

1.血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

2.血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

3.組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

4.細胞培養物上清：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

5.其它生物標本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。

6.樣品外觀：樣品應清澈透明，懸浮物應離心去除。

7.樣品保存：樣品收集后若在1周內進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內檢測），或-80℃（6個月內檢測），避免反復凍融，標本溶血會影響檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

注意事項：

1.嚴格按照規定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。

2.洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔內液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

3.消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。

4.底物顯色液應呈無色或很淺的顏色，已經變藍的底物液不能使用。

5.避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。

6.在儲存和溫育時避免強光直接照射。

7.平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8.任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。

9.不能使用過期產品。

10.如果可能傳播疾病，所有的樣品都應管理好，按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。

操作步驟：

1．從室溫平衡60min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2．設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL。

3．樣本孔中a加入待測樣本50μL；空白孔不加。

4．除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5．棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。

實驗結果計算：

繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

（此圖僅供參考）

人Ⅴ型膠原(COL5)試劑盒性能：

1. 檢測范圍：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.靈敏度：檢測濃度小于1.0 pg/mL。

3.特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。

4.重復性：板內變異系數小于10% ，板間變異系數小于15% 。

技術小提示：

1.當混合或重溶蛋白溶液時，盡量避免起沫。

2.為了避免交叉感染，配置不同濃度標準品、上樣、加不同試劑都需要更換槍頭。另外不同試劑請分別使用不同的移液槽。

3.每次孵育時，請正確使用封板膠可保證結果的準確性。

4.混合后的顯色底物在上板前應為無色，請避光保存；假如微孔板后，將由物色變成不同深度的藍色。

5.終止液上板順序應同顯色底物上板順序一致；加入終止液后，孔內顏色由藍變黃；若孔內有綠色，則表明孔內液體未混勻；請充分混合。

說明：

1.由于現有條件及科學技術水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析，本產品可能存在一定的質量技術風險。

2.實驗結果與試劑的有效性、實驗者的相關操作以及當時的實驗環境密切相關，請務必準備充足的標本備份。

3.不同批次的同一產品可能會有少許差別，如：檢測限、靈敏度以及顯色時間等，請依據試劑盒內說明書進行實驗操作，網站電子版說明書僅作參考。

4.只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果，不能混用其他制造商的產品。只有嚴格遵守本試劑盒的實驗說明才會得到的檢測結果。