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彈性蛋白酶發酵工藝條件優化研究

2011/3/9 [2082]

本研究以我實驗室分離、篩選的彈性蛋白酶產生菌—Pseudomonas sp作為出發菌株,利用誘變因子的協同作用,對其進行了誘變育種,得到酶活力較高的菌株Pseudomonassp SWU-B;研究了該菌株產彈性蛋白酶的動態變化過程;比較了不同的營養源與生長條件對菌株產彈性蛋白酶的影響,優化、確定了菌株產彈性蛋白酶的發酵培養基;探討了菌株發酵產彈性蛋白酶的影響因素;初步確定了菌株發酵產彈性蛋白酶的工藝參數,結果如下: 1.三種不同的誘變因子對Pseudomonas sp菌體細胞的致死作用表現出相似的趨勢,在一定范圍內都與誘變劑量呈線性正相關,存活曲線呈指數型的“肩型”。利用紫外線(UV)、氯化鋰(LiCl)和甲基磺酸乙酯(EMS)復合誘變的協同效應,在UV(2537~*10~(-10)m,30cm處,輻照60s)、EMS浸泡45min后,涂布于含有0.3%LiCl的脫脂奶營養瓊脂平板(NSM)上。在協同誘變條件下,多輪反復誘變Pseudomonas sp后,菌株的酶活力有所提高,篩選到了彈性蛋白酶活力單位提高了35.49%的菌株—Pseudomonas sp SWU-B。誘變因子的復合、協同誘變,可以減弱單一誘變劑反復誘變產生的誘變抗性和飽和性,是一種有效的選育優良菌株的方法。 2.復合碳源有利于假單胞菌SWU-B (Pseudomonas sp SWU-B)產彈性蛋白酶;碳氮比(C/N)低的營養源,發酵液的zui終pH=8.2±0.4,利于彈性蛋白酶的產生和活性的穩定。葡萄糖、蔗糖混合碳素為營養源時,菌株產彈性蛋白酶的能力優于單一的碳源,能夠促進菌株產生彈性蛋白酶;干酪素是產彈性蛋白酶的*氮源。試驗結果表明:菌株SWU-B在營養組分為(g/L):葡萄糖,1%;蔗糖,3%;干酪素,3%;Na_2HPO_4,0.3%;MgSO_4.7H_2O,0.01%;pH=7.2的液體培養基中能夠較大限度地產生彈性蛋白酶。 3.Pseudomonas sp SWU-Bzui適生長溫度為37℃,16h進入生長穩定期,在此時菌株開始大量的產生、分泌彈性蛋白酶;在28℃、150rpm振蕩、12h種子液、4%接種量時,利于菌體產彈性蛋白酶,24h時達到產酶高峰。 4.菌體細胞壁膜的滲透性對彈性蛋白酶的分泌有較大的影響,發酵液中Tween80為0.2%(v/w)時能有效地促進酶的產生分泌;青霉素通過破壞細胞壁中的肽聚糖,改變細胞膜、壁的結構,能增加菌體的通透性,促進彈性蛋白酶 中文摘要 的分泌,其具體機制需要進一步研究。 5.彈性蛋白酶的親和底物能激活 Pseudomonas Sp SWU-B菌體產彈性蛋白酶 的機制,促進彈性蛋白酶的產生。彈性蛋白、大豆分離蛋白均能誘導酶的產 生。發酵培養基中添加 0.40%(w/w)的大豆分離蛋白,能較好的誘導菌體產彈 性蛋白酶。酪氨酸、精氨酸能促進酶的產生,0刀1%的酪氨酸效果較好。 6.補加碳源、氮源和分段變溫培養利于菌體產生彈性蛋白酶,在 12h時補 加一倍的營養源、改變培養溫度能有效的促進酶的產生。添加消泡劑,改善了 菌體的生長環境,有利于彈性蛋白酶的產生。以花生油為消泡劑時,0.3%的添 加量效果較佳。 7.在優化的發酵條件下,Pseudomonas Sp SWU習經 24h五批次發酵后,原 發酵液平均酶活力達到 28UhaL,zui高達到 32U/inL,發酵液經鹽析《NH4) 劣O*和透析,酶的比活力達到 100U/mg.蛋白質,其潛在的開發價值較大。
 

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