小鼠單個核細胞分離一步梯度法去除死細胞

2010-06-24 [2533]

基本原理

活細胞（密度較小）和死細胞（密度較大）密度不同，從而有助于將活的淋巴細胞和紅細胞分離。

附加材料

高密度溶液：Ficoll-Paque（Ficoll和泛影酸鈉；Pharmacia LKB）或Lympholyte-M（Cedarlane）

12ml或50ml聚丙烯離心管（比聚苯乙烯離心管好）

注：Ficoll-Paque和Lympholyte-M的密度與溫度有關；該方法中所采用的以及其他商品化的高密度溶液適合在室溫中使用。因此應注意使細胞懸液、離心和高密度溶液控制在室溫。否則會因活細胞沉入離心管底導致在密度界面上損失活細胞。

實驗方案

1、用RPMI-5*培養基混懸細胞，分裝到離心管中使其細胞數達到0.5×10⁸～1×10⁸個細胞/2ml（12ml離心管）或1×10⁸～5×10⁸個細胞/5ml（50ml離心管）。

2、用移液器吸取3ml（使用12ml離心管時）或5ml（使用50ml離心管時）高密度溶液，將槍頭伸到離心管底，緩慢將高密度溶液加入細胞懸液下方。

3、室溫，800g離心15min。為了取得好的分離效果，將離心機的“brake”開關關掉。

4、使用5ml移液器，沿高密度層表面緩慢移動移液器槍頭，吸入漂浮在高密度層上方的活細胞，盡量少收集高密度溶液。將活細胞移入另一管中。

5、加入RPMI-5*培養基（少量細胞加入10ml，細胞量較多時加入40ml），室溫，200g離心10min。重復一次。

6、以適量培養基混懸細胞以便進行下一步操作。